Laboratorijski markeri kod upalnih bolesti crijeva

Zdravlje probavnog sustava je izuzetno bitno zbog njegove velike uloge u apsorpciji i iskorištavanju hranjivih tvari za potrebe cijelog organizma.

Probavni sustav se proteže od glave do trupa te uključuje i veliki broj probavnih žlijezdi. Dijelovi koji pripadaju glavi sudjeluju za prihvat i usitnjavanje hrane i usmjeravanje prema donjim dijelovima probavnog sustava smještanim u području trupa. Tu dolazi do apsorpcije hrane i enzimske razgradnje. Neki dijelovi probavnog sustava sudjeluju samo u prijenosu hrane ili privremenu pohranu neprobavljenih sastojaka hrane. Veliku ulogu u probavnom sustavu ima crijevo koje dijelimo na tanko i debelo crijevo (1). U tankom crijevu se odvija najveći dio enzimske razgradnje hrane i resorpcija hranjivih tvari. Ono je također najveći spremnik vode u ljudskome tijelu zbog čega kod bolesti koje su praćene dijarejom (vodenaste stolice) mogu brzo dovesti do dehidracije. U debelom se crijevu sadržaj (himus) iz tankog crijeva zgušnjava resorpcijom vode. U posljednje vrijeme se velika pažnja posvećuje poveznici zdravlja crijeva i mikrobioma crijeva . Mikrobiom crijeva je kompleksna zajednica mikroorganizama koja obitava u gastrointestinalnom traktu ljudi i drugih životinja. Sastoji se od trilijuna mikroba, uključujući bakterije, viruse, gljivice i protozoe. Domaćin osigurava hranjive tvari i stanište za mikrobe, dok mikrobi zauzvrat obavljaju vitalne funkcije koje podržavaju zdravlje domaćina. Većina tih mikroorganizama nalazi se u debelom crijevu, gdje njihova gustoća doseže najviše razine. Mikrobi obavljaju brojne funkcije, uključujući razgradnju neprobavljivih prehrambenih vlakana, sintezu vitamina (vitamini K i B), zaštitu od patogena i regulaciju imunološkog sustava. Neravnoteža u mikrobioti, poznata kao disbioza, povezana je s različitim zdravstvenim problemima, uključujući gastrointestinalne bolesti (kao što su upalne bolesti crijeva) (2), metaboličke poremećaje ( pretilost i dijabetes), te mentalne zdravstvene probleme (depresija i anksioznost).Postoji sve više dokaza koji povezuju mikrobiom crijeva s mozgom i ponašanjem, koncept poznat kao osovina crijevo–mozak koji se temelji na spoznaji da mikrobi crijeva mogu utjecati na proizvodnju neurotransmitera te utjecati na biološke puteve (3).

Upalna bolest crijeva (engl. Inflammatory bowel disease, IBD) obuhvaća skup kroničnih i idiopatskih upalnih stanja koja pogađaju preko 3,5 milijuna pacijenata širom svijeta. Dva glavna oblika IBD-a su Crohnova bolest (CD), kod koje upala može zahvatiti bilo koji dio gastrointestinalnog (GI) trakta, i ulcerozni kolitis (UC), kod kojeg upala zahvaća unutarnji sloj debelog crijeva ili rektuma. Pacijenti s IBD-om imaju do šest puta veću vjerojatnost za razvoj kolorektalnog karcinoma u usporedbi s općom populacijom (4). Osim molekularnih promjena, upala značajno doprinosi aktivaciji transkripcije mutiranih gena raka. Gubitak funkcije tumorskog supresorskog proteina p53 javlja se i u sporadičnom kolorektalnom karcinomu i u onome povezanom s IBD-om, ali se događa ranije u nedisplastičnoj sluznici kod karcinoma povezanog s IBD-om nego kod sporadičnog karcinoma. Još jedna mutacija koja je prisutna u oba tipa raka je mutacija gena APC, poznata kao gen"vratar". Za razliku od mutacije p53, mutacija APC-a javlja se neposredno prije razvoja karcinoma u kolorektalnom karcinomu povezanom s IBD-om, dok se u sporadičnom karcinomu pojavljuje u mnogo ranijoj fazi (5).

Upalna bolest crijeva karakterizira upala sluznice s izmjenama pojave bolesti i remisije. Kod Crohnove bolesti (CD) upala može zahvatiti bilo koji dio gastrointestinalnog trakta, često uzrokujući strikture, apscese i fistule. Histološki, CD pokazuje zadebljanu submukozu, ulceracije, transmuralnu upalu i granulome (6). Kod ulceroznog kolitisa (UC) upala zahvaća unutarnji sloj debelog crijeva ili rektuma i širi se kontinuirano, uz površinske upalne promjene i kriptitise. Klinički simptomi IBD-a uključuju bol u trbuhu, proljev, rektalno krvarenje, gubitak težine, mučninu, bol u crijevima i ponekad groznicu. Budući da ovi simptomi nisu specifični za IBD, dijagnostika mora uključivati kombinaciju endoskopskih, radioloških, kliničkih, histoloških i laboratorijskih testova. Endoskopija i slikovne metode ključne su za dijagnozu i liječenje IBD-a (7). Nove endoskopske tehnike poput video kapsularne endoskopije (VCE), konfokalne laserske endomikroskopije (CLE) i enteroskopije s balonom (SBE i DBE) omogućuju precizniju dijagnozu IBD-a i razlikovanje CD-a i UC-a. Također, presječni slikovni modaliteti kao što su magnetska rezonancijska enterografija (MRE), ultrazvuk (US) i kompjuterizirana tomografija (CT) pomažu u dijagnozi i praćenju IBD-a, posebno u otkrivanju komplikacija izvan dosega kolonoskopije. Ove tehnike su ključne jer se CD i UC razlikuju u prognozi i terapiji.

Iako slikovne tehnike nude vrlo točnu dijagnozu IBD-a, zahtijevaju iskusno osoblje, sofisticirane instrumente i visoke troškove, što otežava njihovu rutinsku primjenu. Prednost laboratorijskih testova leži u njihovoj standardizaciji, brzini provedbe i troškovnoj isplativosti. Oni se također mogu primijeniti na već postojeće baze uzoraka pacijenata u okviru  neovisnih istraživanja. Kombinacija laboratorijskih testova s endoskopijom ili slikovnim tehnikama sve se češće koristi za praćenje aktivnosti bolesti ili dijagnosticiranje sumnjivih slučajeva IBD-a. Kako bi laboratorijski testovi bili učinkoviti, važno je pravilno koristiti molekularne biomarkere iz tkiva, krvi (seruma) ili uzoraka stolice pacijenata. Nekoliko upalnih serumskih biomarkera postali su dio rutinskog laboratorijskog testiranja za dijagnozu IBD-a. Iako nisu specifični za IBD, ovi serumski biomarkeri često se koriste za početnu dijagnozu zbog svoje jednostavnosti, niske cijene i dobro uspostavljenih protokola. Najčešći testovi uključuju C-reaktivni protein (CRP) i brzinu sedimentacije eritrocita (ESR). CRP je pentamerni protein koji se proizvodi u jetri (Slika1). U serumu se nalazi u koncentraciji manjoj od 1 mg/L u fiziološkim uvjetima, a njegova koncentracija raste tijekom akutne faze odgovora kada pro-upalni citokini kao što su IL-6, TNF-alfa i IL-1 beta stimuliraju njegovu proizvodnju. CRP ima kratak poluživot (oko 19 sati), što ga čini boljim indikatorom upale od većine proteina akutne faze. Povišene razine CRP-a primijećene su u većini aktivnih slučajeva Crohnove bolesti (CD), dok razine CRP-a kod pacijenata s ulceroznim kolitisom (UC) pokazuju malo do nikakvo povećanje u slučaju aktivne bolesti. To može biti rezultat proizvodnje CRP-a od strane mezenteričnih adipocita kod pacijenata s CD-om (8) (Slika1). Iako se CRP široko koristi kao biomarker za IBD, nedostaje mu specifičnost jer su povišene razine CRP-a također prisutne u autoimunim poremećajima, infekcijama i malignitetima.

ESR je mjera brzine taloženja eritrocita kroz plazmu, pri čemu se veća brzina smatra pokazateljem više upale. Vrijednosti ESR-a pod utjecajem su fizioloških čimbenika poput trudnoće, dobi i spola, kao i promjena hematokrita kod pacijenata s anemijom i policitemijom. Lijekovi koji mijenjaju veličinu eritrocita također mogu utjecati na vrijednosti ESR-a. Promjene u vrijednostima ESR-a nisu specifične za IBD i mogu biti uzrokovane bilo kojim upalnim podražajem. Za razliku od CRP-a, vrijednosti ESR-a mijenjaju se i kod UC-a i CD-a, te ih ne možemo razlikovati. ESR doseže vrhunac sporije od CRP-a i duže mu treba da se vrati na normalu nakon upalnog napada. CRP ima prednosti nad ESR-om, jer se njegova koncentracija mijenja brže s promjenom aktivnosti bolesti, ima širi raspon abnormalnih vrijednosti i ne pokazuje dobne varijacije. Leucin-bogati alfa-2 glikoprotein (LRG) je protein koji luče hepatociti, neutrofili, makrofagi i crijevne epitelne stanice. Nedavno se pojavio kao novi serološki biomarker za IBD i reumatoidni artritis. Studije su pokazale da su razine LRG-a povišene kod pacijenata s aktivnim UC-om i smanjuju se s padom aktivnosti bolesti. Značajno je da povišene razine LRG-a bolje koreliraju s kliničkim i endoskopskim rezultatima kod pacijenata s aktivnim UC-om i CD-om nego CRP. Također je otkriveno da LRG predviđa zacjeljivanje sluznice kod pacijenata s UC-om i CD-om s normalnim razinama CRP-a (9).

Serološko testiranje je dobro uspostavljen dijagnostički alat za razne imunološke bolesti, a njegova upotreba kod IBD-a uglavnom je usmjerena na pacijente s potvrđenom dijagnozom (10). Malo je istraživanja provedeno o njegovom potencijalu kao primarnog dijagnostičkog alata kod pacijenata sa sumnjom na IBD. Perinuklearna anti-neutrofilna citoplazmatska antitijela (p-ANCA) i anti-Saccharomyces cerevisiae antitijela (ASCA) dva su glavna antitijela koja se trenutno ispituju u studijama IBD-a. ANCA su skupina antitijela proizvedenih protiv antigena u citoplazmi neutrofila, dok su ASCA antitijela proizvedena protiv komponenti stanične stjenke kvasca (11). Oba su pokazala klinički korisne prediktivne vrijednosti: p-ANCA+/ASCA- često je prisutna kod pacijenata s UC-om, dok se p-ANCA-/ASCA+ viđa kod pacijenata s CD-om. Iako se ovi biomarkeri mogu koristiti za razlikovanje UC-a od CD-a, imaju nisku točnost i osjetljivost, a pozitivni rezultati nisu jedinstveni za IBD te se mogu povezati s drugim stanjima poput celijakije, Behcetove bolesti, cistične fibroze i reumatoidnog artritisa.

Fekalni biomarkeri su proteini koji se nalaze u uzorcima stolice pacijenata s IBD-om. Fekalni biomarkeri za IBD koji su dosad prijavljeni uglavnom su fekalni leukocitni proteini. Oni uključuju kalprotektin, kalgranulin C, laktoferin i lipokalin-2 (Slika1). Oni imaju nekoliko prednosti u odnosu na krvne biomarkere, uključujući jednostavnost pristupa uzorcima, visoku koncentraciju biomarkera zbog izravnog kontakta fekalnog uzorka s mjestom upale i veću specifičnost za IBD jer odražavaju GI upalu. Kalprotektin je najrašireniji fekalni biomarker za IBD (12). To je protein koji veže kalcij i cink, a obilan je u neutrofilima, eozinofilima i makrofagima. Promjene u njegovoj koncentraciji opažene su u raznim sekretornim i ekskretornim proizvodima u tijelu nakon aktivacije granulocita i mononuklearnih fagocita. Povišene razine fekalnog kalprotektina očekuju se kod pacijenata s aktivnim IBD-om, zbog prisutnosti velikog broja neutrofila u GI traktu, što je karakteristično za bolest. Kalprotektin je otporan na razgradnju i stabilan je 7 dana u fekalnim uzorcima pohranjenim na sobnoj temperaturi. Promjene u razinama fekalnog kalprotektina nisu isključive za IBD; promjene se također opažaju kod raznih bolesti debelog crijeva. U novije vrijeme testira se dijagnostički test  fCAL-turbo, novi brzi potpuno automatizirani test za kalprotektin temeljen na metodi imunotestiranja uz pojačanje čestica turbidimetrijom, pokazao je jake i značajne korelacije s drugim utvrđenim standardnim testovima. Nadalje, zabilježena je umjerena korelacija s endoskopskom aktivnošću kod pacijenata s UC, ekvivalentna onoj viđenoj s drugim testovima. Konkretno, fCAL-turbo je pokazao izvrsnu učinkovitost u predviđanju endoskopske remisije kod pacijenata s UC, jednaku kao i drugi standardni testovi. Na temelju svojih prednosti, uključujući brze rezultate (15 nasuprot 150 minuta trajanje testa) i troškovnu učinkovitost (nasumično testiranje nasuprot serijske analize), upotreba fCAL-turbo seta može značajno povećati kliničku učinkovitost strategije liječenja usmjerene na cilj za slučajeve IBD-a (13) (Slika 1).

Kalgranulin C (S100A12) pripada obitelji S100 proteina male molekularne mase koji vežu kalcij, a koji aktiviraju NF-kB put i povećavaju oslobađanje citokina tijekom pro-upalnih procesa. Serumska koncentracija kalgranulina C je visoka kod IBD-a, ali je fekalna koncentracija viša, što čini fekalni test osjetljivijim za IBD. Povišene razine kalgranulina C prijavljene su i kod drugih upalnih stanja, kao što je artritis. Kalgranulin B (S100A9) je također pokazao poveznicu s IBD te je biomarker koji se još testira u dijagnozi UC (14). Laktoferin je još jedan biomarker čije su razine značajno povišene kod aktivnog IBD-a. To je glikoprotein koji veže željezo i specifično se nalazi u neutrofilima; u tom pogledu se razlikuje od kalprotektina, koji se nalazi u nekoliko tipova stanica. Laktoferin ima visoku specifičnost i osjetljivost za dijagnosticiranje aktivnog IBD-a. Lipokalin-2 (LCN-2), također poznat kao neutrofilni želatinaza-asocirani lipokalin (NGAL) ili siderokalin (Scn), je bakteriostatski protein pohranjen u granulama neutrofila. LCN-2 sudjeluje u urođenom imunitetu odvajanjem željeza od patogenih bakterija, ograničavajući njihovu invaziju. To je vrlo stabilan protein čija je povišena ekspresija u epitelnim stanicama crijeva dokazana u biopsijama debelog crijeva iz upaljenih područja pacijenata s IBD-om. Serumski LCN-2 dokazano je aktivni biomarker kod pacijenata s UC-om, i široko se koristi kao fekalni biomarker akutne upale u životinjskom modelu UC-a, što ukazuje na to da bi se mogao potencijalno koristiti kao fekalni biomarker za ljudski UC. Vjeruje se da je upregulacija LCN-2 inducirana IL-22 i IL-17A.

Glavni problem oko dijagnoze i prognoze IBD-a koja se oslanja isključivo na pojedinačne molekularne biomarkere je njihova točnost detekcije. Studija je pokazala da koeficijenti korelacije biomarkera s endoskopijom mogu varirati od 0,48 do 0,83 (za kalprotektin) i od 0,19 do 0,87 (za laktoferin) kod pacijenata s IBD-om. Metode otkrivanja IBD-a koje kombiniraju endoskopiju s histopatološkim biomarkerima mogu biti vrlo točne, kao u kontekstu onkostatina M (OSM) ili receptora za onkostatin M (OSMR), za koje je utvrđeno da su visoko prekomjerno izraženi u upaljenom crijevnom tkivu pacijenata s aktivnim IBD-om. Do danas se C-reaktivni protein i fekalni kalprotektin smatraju pouzdanim markerima aktivnosti bolesti, s dokazanom korisnošću u upravljanju IBD-om. Međutim, detekcije temeljene na pojedinačnim biomarkerima često predstavljaju veće nejasne "sive zone" nego detekcije napravljene korištenjem kompozitnih biomarkera. Kompozitni biomarkeri definiraju se kao "kombinacija ≥2 biomarkera" i odabiru se pomoću optimiziranog algoritma kako bi dali jedinstven interpretativni rezultat. Kombinacija različitih biomarkera pokazala je veću točnost i očekuje se da će smanjiti "sivu zonu" svakog biomarkera te zamijeniti pristupe s pojedinačnim biomarkerima u budućnosti istraživanja i kliničke prakse. Zadnja istraživanja  uključivala su analize fekalnih proteina pomoću sveobuhvatnog panela aptamera koji je pokazao superiornost u odnosu na  fekalni kalprotektin u praćenju bolesti i predikciji kod IBD-a (15).

Nedavne studije su otkrile da su promjene u crijevnoj mikrobioti i metabolitima povezane s promjenama u ljudskom zdravlju i raznim bolestima, uključujući upalnu bolest crijeva. Novije studije ukazuju na opće obrasce promjena u crijevnom mikrobiomu i metabolomu kod pacijenata s IBD. Ove informacije mogu biti vrijedne za istraživanje daljnjih intervencija i tretmana za IBD. Daljnja istraživanja trebala bi potvrditi i detaljnije istražiti temeljne molekularne mehanizme uključujući  longitudinalne studije i intervencije. Iako promjene  mikrobiote i metabolita obećavaju pozitivan smjer u liječenju pojedinih zdravstvenih stanja, one također predstavljaju velike izazove i s etičke strane koje zahtijevaju pažljivu evaluaciju, na primjer, varijacije mikrobiote te standardizacija u smislu interpretacije rezultata. Longitudinalne studije su ključne za potpuno razumijevanje kako se crijevni mikrobiom i metabolom mijenjaju tijekom različitih faza IBD-a i kao odgovor na terapiju (16). U laboratoriju Synlab također se provodi testiranje mikrobioma crijeva putem testa myBIOM gdje se pomoću tehnologije sekvenciranja nove generacije (engl. „Next-Generation Sequencing”, NGS) sekvencira cjelokupan genetski materijal (DNK) crijevne mikrobiote (Slika 1).

Uloga endoskopije i upalnih biomarkera u dijagnozi IBD-a opsežno je proučavana tijekom godina, što je značajno poboljšalo naše razumijevanje korisnosti i ograničenja svakog dijagnostičkog alata u kliničkoj praksi. Iako je kombinacija endoskopije i molekularnih testova postala dobro uspostavljen dijagnostički alat za IBD, i dalje se ulažu napori kako bi se pronašao idealan dijagnostički alat koji može prevladati trenutne izazove. U posljednje vrijeme raste interes za prelazak s korištenja pojedinačnih biomarkera na panel biomarkera, s ciljem identificiranja kombinacija koje su specifične za IBD i omogućuju diferencijalnu dijagnozu između UC-a i CD-a. Ova promjena u fokusu istraživanja očituje se u sve većem broju studija koje koriste proteomiku i genomiku za identifikaciju potpisa biomarkera.

Slika 1. Prikaz aktualnih serumskih, seroloških i fekalnih biomarkera upalne bolesti crijeva te analize mikrobioma (Slika izrađena u Biorender programu)

Članak napisala: 

Prof.dr.sc. Lovorka Grgurević

Literatura:

1. Duale Reihe, Anatomija, 3.prerađeno izdanje, Medicinska naklada, 2018.
2. Annu Rev Med. 2022 January 27; 73: 455–468. doi:10.1146/annurev-med-042320-021020.
3. Morais, L.H., Schreiber, H.L. & Mazmanian, S.K. The gut microbiota–brain axis in behaviour and brain disorders. Nat Rev Microbiol 19, 241–255 (2021). https://doi.org/10.1038/s41579-020-00460-0
4. Keller, D.S.; Windsor, A.; Cohen, R.; Chand, M. Colorectal cancer in inflammatory bowel disease: Review of the evidence. Tech. Coloproctol. 2019, 23, 3–13
5. Peng H, Ying J, Zang J, Lu H, Zhao X, Yang P, Wang X, Li J, Gong Z, Zhang D, Wang Z. Specific Mutations in APC, with Prognostic Implications in Metastatic Colorectal Cancer. Cancer Res Treat. 2023 Oct;55(4):1270-1280. doi: 10.4143/crt.2023.415. Epub 2023 Apr 24. PMID: 37114476; PMCID: PMC10582542.
6. Zhang, Y.Z.; Li, Y.Y. Inflammatory bowel disease: Pathogenesis. World J. Gastroenterol. 2014, 20, 91–99.
7. Simpson, P.; Papadakis, K.A. Endoscopic evaluation of patients with inflammatory bowel disease. Inflamm. Bowel Dis. 2008,14, 1287–1297
8. Peyrin-Biroulet, L. et al. Mesenteric fat as a source of C reactive protein and as a target for bacterial translocation in Crohn’s disease. Gut 2012, 61, 78–85
9. Shinzaki, S.; Matsuoka, K.; Iijima, H.; Mizuno, S.; Serada, S.; Fujimoto, M.; Arai, N.; Koyama, N.; Morii, E.; Watanabe, M.; et al. Leucine-rich Alpha-2 Glycoprotein is a Serum Biomarker of Mucosal Healing in Ulcerative Colitis. J. Crohn’s Colitis 2017,11, 84–91.)
10. Sellin, J.H.; Shah, R.R. The Promise and Pitfalls of Serologic Testing in Inflammatory Bowel Disease. Gastroenterol. Clin. N. Am. 2012, 41, 463–482.
11. Mokrowiecka A, Gasiorowska A, Malecka-Panas E. pANCA and ASCA in the diagnosis of different subtypes of inflammatory bowel disease. Hepatogastroenterology. 2007 Jul-Aug;54(77):1443-8. PMID: 17708273.
12. Poullis, A.; Foster, R.; Mendall, M.A.; Fagerhol, M.K. Emerging role of calprotectin in gastroenterology. J. Gastroenterol. Hepatol.2003, 18, 756–762.
13. Oka, A., Kawashima, K., Kishimoto, K. et al. Validation of rapid fecal calprotectin assay using particle enhanced turbidimetric immunoassay for inflammatory bowel disease. Sci Rep 14, 1653 (2024). https://doi.org/10.1038/s41598-024-51580-z
14. Soomro, S., Venkateswaran, S., Vanarsa, K. et al. Predicting disease course in ulcerative colitis using stool proteins identified through an aptamer-based screen. Nat Commun 12, 3989 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-24235-0
15. Ning, L., Zhou, YL., Sun, H. et al. Microbiome and metabolome features in inflammatory bowel disease via multi-omics integration analyses across cohorts. Nat Commun 14, 7135 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-42788-0